Адразу па ўзыходжанні Жуана III, брата Ізабелы, на каралеўскі сталец Партугаліі ў 1521 годзе, пачаліся перамовы паміж партугальскім і іспанскім каралеўскімі дварамі, мэтай якіх быў шлюб Ізабелы з Карлам, які адначасова спалучаў стальцы Свяшчэннай Рымскай Імперыі і каралеўстваў Кастыліі і Арагона.
У выніку Ізабела і Карл завочна пабраліся шлюбам у 1525 годзе. Пасля цырымоніі Інфанта накіравалася ў Іспанію, дзе яна пабралася сапраўдным шлюбам з Карлам у Севільі10 сакавіка1526 года. Нягледзячы на тое, што іх вяселле было вынікам палітычных манеўраў, іх саюз спраўдзіўся як саюз кахання. Успаміны сведак кажуць, што «калі яны (Карл і Ізабела) разам, яны не заўважаюць нікога, нават калі навокал шмат людзей — яны смяюцца і размаўляюць, і нішто не можа іх патурбаваць».
Ізабела таксама спраўдзілася як вельмі кампетэнтны кансорт. Яна была рэгентам Іспаніі падчас адсутнасці свайго мужа ў 1529—1532 гг. і 1535—1539 гг. Яна ўслаўлена сучаснікамі за прыгажосць і розум.
Ізабела памерла заўчасна ў 1539 годзе пасля родаў. У гэты час імператар быў у ад’ездзе. Яе заўчасная смерць моцна ўплыла на яго — імператар не ажаніўся зноў і апранаўся ў чорнае астатняе жыццё.
.svg){kind=small}
